正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。 他们合力与恶势力展开斗争……
黛西·雷德利,亚当·德赖弗,奥斯卡·伊萨克,约翰·博耶加,马克·哈米尔,凯丽·费雪,比利·迪·威廉姆斯,伊恩·麦克迪阿梅德,凯丽·拉塞尔,哈里森·福特,朱迪·科默,比利·豪尔,马特·史密斯,露皮塔·尼永奥,多姆纳尔·格里森,凯莉·玛丽·陈,乔纳斯·索塔莫,比莉·洛德,安东尼·丹尼尔斯,娜奥米·阿基,理查德·E·格兰特,多米尼克·莫纳汉,格雷戈·格伦伯格,艾德·希兰,林-曼努尔·米兰达